4.3 GSEA

1) Pipeline

2) data structure

2a) getting software & data

• 程序下载与安装（Docker 中均已安装好）：
  • 进入 GSEA官方下载页面（需要登录方可进入，只需输入邮箱即可），在 Software tab下载 "javaGSEA Java Jar file"。已经安装。
  • 安装 Java8 。已经安装
  • qGSEA 已经安装。感兴趣请看 4) Tips/Utilities 安装 qGSEA。
• 准备数据：至 GEO 查找感兴趣的数据集（本例中我们使用 GSE19161），下载 series_matrix.txt.gz 文件和family.soft.gz 文件（Docker 中已经下载好）。

2b) input format

参见 http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideTEXT.htm#_Preparing_Data_Files

2c) output format

网页格式的输出信息，使用说明见 http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideTEXT.htm#_Interpreting_GSEA_Results。

3) Running Steps

这里我们分析 GSE19161 数据集中与 EIF4G2 基因的表达量显著相关的 gene set。

首先进入到容器（在自己电脑的 Terminal 中运行，详情请参见 这里）：

docker exec -it bioinfo_tsinghua bash

以下步骤均在 /home/test/gsea/ 下进行:

cd /home/test/gsea/

3a) 准备 GSEA 输入文件

官方指南见 http://software.broadinstitute.org/cancer/software/gsea/wiki/index.php/Data_formats

如果你想利用 GEO 的原始数据，qGSEA 这个R包会让你轻松许多。

1. 我们已经在 raw 中下载好了原始数据文件：
   • matrix 文件 GSE19161_series_matrix.txt.gz
   • SOFT 文件 GSE19161_family.soft.gz
2. 生成 GSEA 输入文件（打开R）

R
# 进入 R 操作界面
> dir.create('input/')

> qGSEA::make_gsea_input(
matrix_file = 'raw/GSE19161_series_matrix.txt.gz',
soft_file = 'raw/GSE19161_family.soft.gz',
output_dir = 'input/',
gene = 'EIF4G2'
)
> q()
Save workspace image? [y/n/c]: n # 按 n 再按 Enter

1. 现在目录结构如下：

   gsea
   ├── input
   │   ├── GSE19161.chip
   │   ├── GSE19161.cls
   │   └── GSE19161.txt
   └── raw
       ├── GSE19161_family.soft.gz
       └── GSE19161_series_matrix.txt.gz
   

3b) 在 command line 下运行GSEA

GSEA 可以以图形化界面或 command line 模式运行。由于 Docker 的限制，我们将前者移到了 这里。至于 command line 模式，官方指南 并没有对参数的名称和意义给出详细的解释，而是推荐在图形化界面中运行成功后，导出其所用的命令（示例见 这里）。

这里我们已经事先从图形化界面中导出了所需的命令：

java -cp /usr/local/GSEA/gsea-3.0.jar -Xmx512m xtools.gsea.Gsea -res input/GSE19161.txt -cls input/GSE19161.cls#EIF4G2 -chip  input/GSE19161.chip -out output -gmx  gseaftp.broadinstitute.org://pub/gsea/gene_sets_final/h.all.v6.2.symbols.gmt -metric Pearson

# java -cp /usr/local/GSEA/gsea-3.0.jar -Xmx512m xtools.gsea.Gsea \
#    -res input/GSE19161.txt -cls input/GSE19161.cls#EIF4G2 -chip input/GSE19161.chip -out output \
#    -gmx gseaftp.broadinstitute.org://pub/gsea/gene_sets_final/h.all.v6.2.symbols.gmt -metric Pearson

1. 第一行指定运行的程序
2. 第二行是输入/输出文件的路径（其中 #EIF4G2 指定了我们要分析的基因）
3. 第三行设置了一些参数：
   • 这里我们使用 hallmark 这个 gene set collection (h.all.v6.1.symbols.gmt)；
   • 另外，由于我们使用的是连续性表型（EIF4G2 基因的表达量），Metric 要选 Pearson

输出结果为 output/my_analysis.Gsea.1534401449035/ （最后的数字每次运行都不尽相同）。可以将其复制到 /home/test/share 中，然后在自己的电脑（或虚拟机）中用浏览器打开其中的 index.html，示例可在这里查看。

其中 my_analysis 可以用 -rpt_label 指定为其它值，如 -rpt_label GSE19161。但GSEA会自动在其后添加 .Gsea.1534401449035 来组成输出文件夹名。

4) Tips/Utilities

选择性练习

• 安装 qGSEA（打开R）

R
# 进入 R 操作界面
> if (!('devtools' %in% .packages(T))) install.packages('devtools')
> devtools::install_github('dongzhuoer/qGSEA')
> q()
Save workspace image? [y/n/c]: n # 按 n 再按 Enter。

4a) 使用 qGSEA 下载 GEO 的原始数据

新建一个空文件夹，进入其中，打开R

R
# 进入 R 操作界面
> dir.create('raw/')
> download.file(rGEO::gse_soft_ftp('GSE19161'), 'raw/GSE19161_family.soft.gz')
> download.file(rGEO::gse_matrix_ftp('GSE19161'), 'raw/GSE19161_series_matrix.txt.gz')

> q()
Save workspace image? [y/n/c]: n # 按 n 再按 Enter, 不保存 R 的修改。

/home/test/gsea/raw 中的原始数据文件即是用上述代码得到的。

4b) 以图形化界面运行 GSEA

由于 Docker 中无法启动图形化界面，本步骤需要在自己的电脑或虚拟机中进行。

1. 切换到自己的电脑，装好全部软件，新建一个空文件夹 gsea/，在其中准备好输入文件。

2. 打开 GSEA： java -jar /path/to/gsea-x.y.jar，用文件管理器打开 input/ 文件夹，将上述生成的文件拖拽到指定区域。

   

3. 选择合适的参数，参数意义详见 command line 模式 第 3 行的解释。

   

4. 运行成功后，Status 会显示为 Success，点击其即可查看输出。在本例中，没有一个 gene set 通过了显著性检验。

   

4c) 以图形化界面运行 GSEA

在上一步运行成功后，点击 Command 按钮，即可获取运行时所用的命令，如下图所示：

在实践中，使用默认值的参数也可以不指定，如 上文 所示。

4d) 常见错误：筛选后无基因集

由于基因芯片仅分析一部分基因，有些 gene set 会因为包含的基因过少而被剔除 。在极端情况下，可能所有的 gene set 都会被剔除，这时就会发生如下错误：

更多信息请参见http://software.broadinstitute.org/cancer/software/gsea/wiki/index.php/1001

4e) 分析离散型表型

GSEA也可以分析与离散型表型显著相关的 gene set （与差异表达相似），与上文不同的地方在于 .cls 文件。

以 GSE2251 例，打开链接后，可以在 Samples 一栏找到样品信息。本例共有12个样本，其中第1, 2, 3, 7, 8, 9 号为"E2-8"，第4, 5, 6, 10, 11, 12 号为"vehicle"。针对这一表型的.cls 文件如下所示。12 是样本总数，2 是表型类型数目，0 代表第一种表型，1 代表第二种表型。（样本数过多时，网页会显示不全，这时可以解压并打开 _series_matrix.txt.gz 查看样本信息。）

12 2 1
# E2-8 vehicle
0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1

5) Homework and more

1. 分析 GSE2251 中与 TP53 基因的表达量显著相关的 gene set，输入文件在 这里 下载。

注意：要求提交中间过程产生的文件(chip，cls，txt), 和最后结果，截图并解释。