3.Conservation Analysis

1) Pipeline

2) Data Structure

程序下载与安装：进入 MEGA官方网站，分别下载并安装与计算机操作系统（McOS、Windows、Linux等）相应的软件版本。目前推出了MEGA7.0版本，本节主要介绍这种软件最新版本构建系统进化树的方法。
准备材料：下载已经准备好的拟南芥SWEET家族Protein序列的fasta格式文件，“clustal.fa”。

2a) Inputs

Format	Description	Notes
fasta	多个蛋白序列或核酸序列的集合	用于进行序列比对分析
mega	MEGA软件进行序列分析结果	用于MEGA软件系统发育树构建

2b) Outputs

Format	Description	Notes
mega	MEGA软件进行序列分析的结果	用于MEGA软件系统发育树构建
EMF	发育树导出格式之一	独立的格式，可以保持图形精度
PNG	发育树导出格式之一	位图文件格式，图片存在压缩，可用多种浏览或编辑软件打开
TIFF	发育树导出格式之一	文图文件格式，印刷常用的图像文件格式
PDF	发育树导出格式之一	常用的文档格式

3) Running Steps

MEGA7.0分析流程

Step1. 打开软件 ：双击MEGA程序图标，打开程序，如图3-1所示。

图3-1 MEGA程序主界面

Step2. 打开序列文件：点击“File”菜单，选择“open a file/session···“，在对话框中找到准备好的 clustal.fa 文件，打开，出现对话框（如图3-2所示），选择“align”进行比对，打开序列比对窗口（如图3-3所示）。

图3-2 程序设置对话框

图3-3 多序列分析窗口

Step3. 进行多序列比对分析：选中所有序列，选择 Alignment 菜单中 Align by ClustalW 选项（如图3-4 所示），用ClustalW程序进行多序列比对，弹出参数设置对话框（如图3-5 所示），使用默认参数，按“OK”键开始比对。比对结束后，选择 Data 菜单中 Export Alignment -> MEGA format 选项（如图3-6 所示），将多序列比对结果导出为MEGA格式保存，保存为 clustal.meg 备用，关闭序列比对窗口。

图3-4 多序列比对分析窗口

图3-5 多序列比对参数设置对话框

图3-6 多序列比对结果保存窗口

Step4. 对序列进行发育树分析:回到MEGA主窗口，选择“Plylogeny”按钮，从中选择构建系统发育树的方法，这里以最邻近法为例，进行介绍（如图3-7 所示）。打开前一阶段生成的clustal.meg打开，弹出“Anaylsis Preferences”对话框（如图3-8 所示），可以对发育树分析的一些参数进行设置。通常情况下，我们修改“Test of Phylogeny”选项，改为“Bootstrap method”方法，然后修改“No. of Bootstrap Replication”为1000，即重抽样的重复数为1000.其他设置均为默认。

图3-7 序列比对结果分析窗口

图3-8 发育树构建对话框

Step5. 个性化视图设置和结果导出：程序运行结束后，弹出“TreeExplorer”窗口（如图3-9 所示），窗口内显示构建的发育树。可以通过“View”菜单下的子菜单，对发育树进行修改。例如“view>option”菜单（图3-10）所示，可以设置不同类型的发育树的枝长，间距，标签的类型和颜色等。最后，将设置完成的发育树，通过“Image”菜单，可以导出EMF、TIFF、PNG或PDF格式（如图3-11所示）。

图3-9 “TreeExplorer”窗口

图3-10 发育树视图效果参数设置窗口

图3-11 PDF格式保存效果

4) Tips/Utilities

目前构建系统进化树的软件和算法有很多，在维基百科中的列举List of phylogenetics software就多达60种以上。下表3-1是列举了现在几种常用软件，其中MEGA是最主流的进化分析软件。

表3-1 分子进化与系统发育主要分析软件

软件名称	网址	说明
MEGA	http://www.megasoftware.net/	美国宾夕法尼亚州立大学Masatoshi Nei开发的分子进化遗传学分析软件
PHYLIP	http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html	美国华盛顿大学Felsenstein开发的一套集成的进化分析工具
PAML	http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html	英国University College London开发，采用最大似然法构树和分子进化模型
PAUP	http://paup.csit.fsu.edu/	国际上最通用的系统树构建软件之一，美国Smithsonion Insitute 开发
RAxML	http://sco.h-its.org/exelixis/web/software/raxml/index.html	大量数据的最大似然法建树常用方法（软件获取地址：https://github.com/stamatak/standard-RAxML）
MrBayes	http://mrbayes.sourceforge.net/	基于贝叶斯方法的建树工具